植物激素乙烯在呼吸跃变型果实成熟过程中发挥重要作用，乙烯通过调控参与多种生物学过程的基因表达调节果实成熟，包括呼吸作用、色素积累、质地改变和风味品质变化等。了解乙烯参与的果实成熟调控对提高果实品质和延长货架期具有重要意义。
近日，Horticulture Research在线发表了重庆大学生命科学学院李正国教授团队题为SlGRAS4 accelerates fruit ripening by regulating ethylene biosynthesis genes and SlMADS1 in tomato的研究论文。
作者前期研究发现绿熟期的野生型番茄果实经低温贮藏后再恢复常温不能完全成熟，而过表达SlGRAS4的转基因番茄果实经历低温后仍可以正常成熟。SlGRAS4的转录水平随着果实成熟逐渐提高，乙烯和其抑制剂1-MCP处理发现SlGRAS4的转录受乙烯调控。过表达SlGRAS4可以明显促进番茄果实成熟，乙烯合成关键基因如SlACS2, SlACS4, SlACO1, SlACO3在过表达果实里的表达量显著提高，而番茄果实成熟负调控因子SlMADS1的转录被显著抑制。
作者此前利用ChIP-seq技术获得了SlGRAS4识别和结合的顺式作用元件核心基序，上述五个基因的启动子上均分布着SlGRAS4的识别位点。进一步利用酵母单杂交和双荧光素酶系统分析发现，SlGRAS4直接结合并激活SlACO1和SlACO3的启动子。
该研究解析了SlGRAS4转录因子通过直接调控乙烯合成基因的表达影响番茄果实成熟，为果实成熟机制提供了新的理论依据。
Fig. 1: Expression patterns of SlGRAS4 in wild-type (WT) tomato.
Fig. 2: Phenotypic characterization of WT and SlGRAS4 transgenic fruit.
Fig. 6: SlGRAS4 directly binds to and activates the SlACO1 and SlACO3 promoters.
重庆大学生命科学学院博士后刘豫东为论文之一作者，李正国教授为通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和重庆市自然科学基金的支持。
文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41438-020-00431-9
关于园艺研究
Horticulture Research 是由南京农业大学与自然出版集团（现Springer Nature）合作创办的英文期刊，是Nature旗下唯一的园艺领域专刊。所有关于园艺作物的基础和理论研究都可以投稿。Horticulture Research 科睿唯安JCR2019影响因子：5.404，位于园艺一区（第1/36名），植物科学一区（第16/234名），遗传学一区（第24/177名）。2019年中科院期刊分区（基础版）：位于园艺小类一区，植物科学小类一区，农林科学大类一区（Top期刊）。
沈阳农业大学草莓团队揭示FvWRKY71促进开花转录调控 ***草莓是蔷薇科草莓属的多年生草本植物，果实风味独特且富含营养，在市场上广受消费者喜爱。植物开花时间是农业生产上一个重要的农艺性状，开花早晚影响着产品收获期，因此在农业生产中具有重要的意义。草莓根据其开花习性分为：一季型草莓（seasonal flowering）和四季型草莓（perpetual flowering），同时草莓成花还伴随着休眠特性，因此草莓开花特性较一年生作物更加复杂。因此，挖掘草莓开花调控基因，揭示其调控花期的分子机制，对于草莓的育种工作和生产实践具有十分重要的意义。
近日，Horticulture Research在线发表了沈阳农业大学草莓科研团队的题为Woodland strawberry WRKY71 acts as a promoter of flowering via a transcriptional regulatory cascade 的研究论文。
该论文首先研究了FvWRKY71 基因的基本特性，发现FvWRKY71 基因在花、红果、生长点处高度表达，表明FvWRKY71蛋白定位于细胞核，在酵母中有转录激活活性。将FvWRKY71 基因在拟南芥和森林草莓（Fragaria vesca）中进行稳定遗传转化，发现过量表达FvWRKY71 的转基因植株提前开花，基因表达分析表明开花相关基因的表达量在转基因植株中显著高于野生型植株。酵母单杂交和荧光素酶实验发现FvWRKY71可以通过直接激活FvFUL、FvSEP1、FvAGL42、FvLFY 、FvFPF1 的表达和间接调控FvFT、FvSPL3、FvSPL4、FvAP1、FvSEP2、FvSEP3 的表达来促进草莓开花。该研究结果丰富了WRKY71转录因子在不同作物中的功能，同时为调控草莓及蔷薇科植物提前开花提供了思路。
Fig. 1 The phenotypes of FvWRKY71-overexpressing transgenic woodland strawberry l
Fig. 2 Proposed transcriptional regulatory cascade whereby FvWRKY71 regulates flowering in woodland
该研究依托辽宁省草莓育种与优质栽培重点实验室完成，沈阳农业大学园艺学院硕士研究生雷莹莹和孙一平为论文的共同之一作者，张俊祥博士为论文通讯作者。该研究得到国家重点研发计划（2019YFD1000200）等项目的资助。
文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41438-020-00355-4
About Horticulture Research
Horticulture Research 是由南京农业大学与自然出版集团（现Springer Nature）合作创办的英文期刊，是Nature旗下唯一的园艺领域专刊。所有关于园艺作物的基础和理论研究都可以投稿。Horticulture Research 科睿唯安JCR2019影响因子：5.404，位于园艺一区（第1/36名），植物科学一区（第16/234名），遗传学一区（第24/177名）。2019年中科院期刊分区（基础版）：位于园艺小类一区，植物科学小类一区，农林科学大类一区（Top期刊）。
不同类型酵母杂交促进各类啤酒出现2019-10-22 08:11
科技日报北京10月21日电 （记者张梦然）根据英国《自然·生态与演化》杂志发表的两篇论文，不同类型酵母杂交可以促进杂交种适应酿造环境，促进不同类型啤酒出现。
几千年来，人类一直使用酵母制造不同的发酵产品，如啤酒和红酒。人类通过驯化方式创造出了许多可以适应不同工业环境的酵母品种，它们是综合了不同亲本种独特特征的杂交种。
比利时VIB-KU鲁汶微生物学中心科学家凯文·维斯特里芬及同事，此次测序了应用于工业生产活动（包括酿造）中的200种酵母的基因组，发现其中四分之一的酵母是4种亲本种的杂交种，并指出杂交帮助综合了可以改进酿造工艺的性状，比如耐冷和糖发酵。研究人员发现，如今的拉格酵母缺少遗传多样性，这可能是因为19世纪末培养、冷藏和供应的酵母菌株只有少数。但是，比利时的酿造师保留了传统的酿造工艺，直到今天都使用一系列不同的酵母菌株制造啤酒。
在另一项研究中，美国威斯康星大学麦迪逊分校科学家克里斯·西金格及同事，分析了122种酵母杂交种的基因组。基因组信息揭示了一段涉及野生菌株和工业生产菌株的复杂杂交史。与酿酒酵母亲本杂交的杂交种可以分为3种驯化谱系，而另外3种亲本均为野生谱系。他们发现若干司陶特啤酒酵母和小麦啤酒酵母与拉格酵母谱系的相似性更大。西金格团队同时也鉴定出了耐冷性状的遗传路径。
综合而言，这两项研究展示了杂交如何促进酵母在酿造环境中的适应和多样化，为开发其他工业生产相关酵母杂交种提供了宝贵的信息。
责编：李文瑶
华南农业大学王海洋团队揭示玉米叶片表皮毛发育的调控机制责编 | 晓彤
表皮毛和气孔是植物叶片表面的两类特化结构，二者协调生长，共同维护表皮稳态，保护表皮下层组织，并在调控植物与外界物质和信息交流及防御反应方面发挥重要作用，其中，表皮毛能有效减轻表皮热负荷，减少水分散失，帮助降低蒸腾，有利于逆境响应。而气孔是控制植物与外界进行气体交换的主要通道，植物通过改变气孔开度来维持水分散失和光合作用之间的平衡，增加叶表皮气孔密度能够提高光合效率和增强植物抗逆能力以适应环境。因此，研究表皮毛和气孔的发育机理对于培育高光效、抗逆性强、适应不同环境条件的作物品种至关重要（Casson and Gray, 2008; Hamanishi et al., 2012; Tricker et al., 2012）。
玉米叶片上表皮有三种类型表皮毛，并且大毛（macrohair），刺毛（prickle hair）和双细胞毛（bicellular hair）和气孔成规律性分布在玉米叶片表皮上，但目前玉米叶片表皮毛和气孔发育发育的时空关系，尤其是表皮毛和气孔细胞命运决定和发育的调控机制仍不清楚（Wei et al., 2020）。
2021年2月24日，华南农业大学王海洋教授课题组在New Phytologist发表了题为ZmSPL10/14/26 Are Required for Epidermal Hair Cell Fate Specification on Maize Leaf 的研究论文，揭示了ZmSPL10/14/26通过调节ZmWOX3A和生长素相关基因的表达促进玉米叶片表皮毛发育的分子机制。
论文系统研究了三种类型表皮毛和气孔的详细细胞学发育过程，表明了玉米叶片三种类型表皮毛和气孔均由原表皮细胞（PDC）通过不均等分裂发育而来。并且他们前体细胞的命运是可以改变的。首次系统报道玉米叶片表皮毛和气孔的发育时空关系。其中，大毛更先发育，起始于气孔世系细胞形成前，在 PDC阶段，已经完成不对称分裂并在早期泡状细胞上形成圆形大毛底座。在 *** C阶段，就已经可以明显观察到大毛明显突出叶表皮外侧，形成类似棒状结构。在GC分裂和GC伸长成熟阶段，大毛突出表皮毛部分继续伸长，能清晰观察到基部的结构。刺毛（ph）和双细胞毛（bh）在正常气孔带上气孔发育的 *** C/SC阶段才进行不均等分裂产生类似GMC的短细胞，直到正常气孔带GMC对称分裂阶段才明显向外延伸，GC完全成熟后期才发育为成熟刺毛和双细胞毛（图一）。
图一. 玉米叶片上气孔和三种表皮毛的发育过程。
首次揭示了ZmSPL10，ZmSPL14和ZmSPL26这三个转录因子在玉米叶片表皮毛和气孔的命运决定中发挥关键作用， Zmspl1010/14/26三突变体叶片上本来应该着生刺毛和双细胞毛的位置均转变为气孔复合体 (图二)。
图二. WT（野生型）和Zmspl10/1426三突变体叶片表皮细胞显微观察。
进一步利用原位杂交，酵母单杂交（Y1H），凝胶阻滞实验（EMSA）和本氏烟草瞬时表达实验证明了ZmSPL10，ZmSPL14和ZmSPL26蛋白能够直接调控ZmWOX3A的表达进而促进表皮毛发育。同时，还发现Zmsp10/14/26三突变体中与生长素合成（ZmYUC2），转运（ZmPIN1b, ZmPIN1c），信号代谢（ZmARF18, ZmARF23和ZmARF28）相关基因的表达水平明显下调。最后，提出ZmSPL10/14/26可能通过调节ZmWOX3A和生长素相关基因的表达促进表皮毛发育的工作模型（图三）。研究结果为阐明玉米和其他禾本科植物表皮毛和气孔的细胞命运决定提供新颖的线索和坚实基础，并为培育高产、抗逆（干旱、高温）玉米新品种提供有益指导。
图三. ZmSPL10/14调控玉米叶片表皮毛和气孔发育的模式图。Protodermal cell：原表皮细胞；bicellular hair：双细胞毛；Asymmetric division：不对称性分裂；Hair primordium: 表皮毛原始细胞；Meristemoid：拟分生组织；Default pathway：默认途径；Ectopic stomata：异位气孔。
华南农业大学孔德鑫副研究员为该论文之一作者，博士研究生景艺峰和已毕业硕士盘璇为该论文共同之一作者。王海洋教授为该论文通讯作者，魏洪彬副教授为该论文共同通讯作者。吴鸿教授参与了该研究。本文得到了广东省基础与应用重点项目，国家自然科学基金的资助。
参考文献：
Casson SA, Gray JE. (2008). Influence of environmental factors on stomatal development. New Phytologist, 178(1): 9-23.
Hamanishi ET, Thomas BR, Campbell MM. (2012). Drought induces alterations in the stomatal development program in Populus. Journal of Experimental Botany, 63(13): 4959-4971.
Tricker PJ, Gibbings JG, Lopez C, Hadley P, Wilkinson MJ. (2012). Low relative humidity triggers RNA-directed de novo DNA methylation and suppression of genes controlling stomatal development. Journal of Experimental Botany, 63(10): 3799-3813.
Ishida T, Kurata T, Okada K, Wada T. (2008). A Genetic Regulatory Network in the Development of Trichomes and Root Hairs. Annual Review of Plant Biology, 59(1): 365-386.
Wei HB, Kong DX, Yang J, Wang HY. 2020. Light regulation of stomata development and patterning: Shifting the paradigm from Arabidopsis to grasses. Plant Communications 1, 100030
文章链接：
https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.17293
文章信息
题目：Group IIc WRKY transcription factors regulate cotton resistance to Fusarium oxysporum by promoting GhMKK2-mediated flavonoid biosynthesis
刊名：New Phytologist
作者：Lijun Wang，Chen Wang,Xingqi Guo et al.
单位：Shandong Agricultural University
日期：21 June 2022?
01
摘要
WRKY 转录因子 (TFs) 是应对病原体感染的关键调节因子。Vasinfectum ( Fov ) 是棉花更具破坏性的病原体，然而，WRKY TFs 对尖孢镰刀菌的调控机制，目前尚不清楚。
在这里，转录组测序表明 IIc 组 WRKY TF 亚家族是响应Fov的最重要的 TF 亚家族。功能获得和功能丧失实验表明，IIc 组 WRKY TF 正向调节棉花对Fov的抗性。一系列染色质免疫沉淀测序、酵母单杂交试验和电泳迁移率变化试验表明，IIc 组的 WRKY TFs 直接与GhMKK2的启动子结合并调节其表达。
重要的是，鉴定了一种由 GhMKK2、GhNTF6 和 GhMYC2 组成的新型丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 级联反应。功能分析表明，IIc 组 WRKY TFs 通过上调 GhMYC2 介导的几个类黄酮生物合成相关基因的表达，诱导 GhMKK2-GhNTF6 通路增加对Fov的抗性，从而导致类黄酮积累。
总之，我们的研究证明了一种新的疾病防御机制，WRKY-MAPK 通路通过该机制促进类黄酮生物合成以防御病原体感染。该途径提高了我们对植物免疫中 WRKY TF 和 MAPK 级联反应模式以及植物类黄酮在病原体防御中的重要作用的理解。
02
技术路线
1、cotton (G. hirsutum L. cv. Lumian 22)
2、four-week-old plants were infected with a Fov spore
suspension (106 conidia/ml) via the root wounding method
3、Library construction, transcriptome sequencing (RNA-seq) and data *** ysis
4、Gene cloning, bioinformatics *** ysis and genetic transformation
5、RNA extraction and real-time quantitative PCR (RT–qPCR) assays
6、Agrobacterium-mediated VIGS
7、ChIP-sequencing (ChIP-seq)
8、Yeast one-hybrid (Y1H) assays
9、Luciferase (LUC) reporter system assays
10、Yeast two-hybrid (Y2H) assays
11、Determination of the flavonoids content
03
主要结果
3.1 转录组分析确定IIc WRKY TFs是参与棉花对Fov抗性的最重要的TFs之一
Fov是棉花种植中更具威胁性的病原体之一。进行转录组测序以鉴定Fov感染后棉花中差异表达的基因，并阐明棉花对Fov抗性的分子机制。结果显示52818个基因，其中7385个上调，8480个下调（表达变化>2倍，Padj<0.05）（图1a和表S3）。然后，对上调基因进行基于GO的富集分析（图1b和表S4）。对于生物过程，大多数上调基因被分配到防御反应（GO:0006952）和生物 *** 反应（GO:0009607）（图1b）。在分子功能类别中，与碳水化合物（GO:0030246）和酰基辅酶A脱氢酶活性（GO:0003995）相关的基因最多（图1b）。在细胞成分类别中，上调基因主要富集于过氧化物酶体（GO:0005777）和微体（GO:0042579）（图1b）。
基于这些结果，Fov入侵诱导了棉花生物过程的各种显著变化。TFs是调节基因表达的主要基因，在植物对病原体的抗性中起着重要作用。对差异表达的TF进行聚类分析，以从我们的转录组数据中获得更多见解。结果表明，WRKY TF比其他TF更显著，52个WRKY tf上调（图1c和S1a，表S5）。进一步的分析表明，大多数上调的WRKY TF被分配到了组Ⅷc WRKY TF亚家族（图1d和S1b）。我们的转录组数据表明，之一类 WRKY TF是棉花对Fov抗性的最重要的TF。
Fig. 1
3.2 之一类WRKY TFs在棉花对Fov的抗性中起着关键作用
使用农杆菌介导的VIGS *** 在棉花中沉默了12个Ⅰ组WRKY TF，以确认Ⅱc组WRKY TF在棉花抗Fov中的功能。在接种后三周，之一组c WRKY TFs的转录水平明显降低（图S2）。棉花植株和Ⅰc WRKY TF组沉默棉花植株的根部均受到损伤，随后用Fov孢子悬浮液（106分生孢子/ml）感染。Fov感染后第7天，尽管不同的Ⅰc WRKY TF沉默棉花植株表现出不同程度的易感性，但所有Ⅰc WRKY TF沉默棉花植株的叶片表现出比对照更明显的黄化迹象（图2a和S3a）。
此外，Ⅲc WRKY TF沉默棉花组的病原体疾病指数显著高于对照组（图2b和S3b， *** S1）。将一组Ⅰd WRKY TF GhWRKY21用作非功能对照，以排除实验系统的人为影响。如图S4所示，尽管GhWRKY21在接种后三周在棉花中被沉默，但GhWRK121沉默棉花的抗性与对照棉花没有明显差异。选择四个棉花组Ⅰc WRKY TF
此外，台盼蓝组织化学染色表明，Fov感染后，所有过表达（OE）系的叶片比Vec系的叶片染色更浅（图2c）。因此，棉花组Ⅷc WRKY TFs正向调节棉花对Fov的抗性。
Fig. 2
3.3 之一类c WRKY TFs与GhMKK2启动子中的W-box元件相互作用
通过其保守的WRKY结构域，WRKY TF识别并结合靶启动子的W-box序列。通过分析差异表达的WRKY TFs中WRKY结构域的结构，我们注意到同一亚科成员的WRKY结构域是保守的，但在不同的家族之间发现了显著的差异（图S6a）。
这一结果表明，之一类c WRKY TFs可能通过结合其启动子中的相同W盒来共同调节靶基因的表达。进行ChIP-seq分析以鉴定启动子中与棉花基团Ⅷc WRKY TFs结合的W-box元件。将瞬时表达四种Ⅰc组WRKY TFs（CotAD_07364、CotAD_16796、CotAD_45940、CotAD_68477）的棉花原生质体混合在一起进行ChIP序列分析。去除低质量数据后，鉴定出516个含有W-box顺式元件的启动子区（图S6b和表S6）。在Fov感染后从棉花中获得的转录组序列与ChIP-seq数据之间进行相关性分析，以筛选由组Ⅷc WRKY TFs调节的Fov诱导基因，结果显示52个基因（图S6c）。
ChIP seq鉴定的516个基因中的其他464个可能是对Fov感染没有反应的IIc WRKY TF结合基因。在预测这52个筛选基因的功能后，选择CotAD_23706进行进一步分析。从棉花中分离并克隆了CotAD_23706。全长CotAD_23706序列为1387 bp，包含187 bp的5’-非翻译区（UTR）、201 bp的3’-UTR和999 bp的开放阅读框（ORF），编码由332个氨基酸组成的蛋白质。序列分析表明，CotAD_23706是丝裂原激活蛋白激酶（MAPKK）家族的成员，与拟南芥中的AtMKK2高度同源，具有保守的激活基序（S/T-xxxxx-S/T，氨基酸192-198）；因此，我们将其命名为GhMKK2（图S7a）。系统发育树分析还证明，与AtMKK2一样，GhMK2属于A组MAPKK家族（图S7b）。
此外，克隆了GhMKK2转录起始位点上游的2311bp片段，并从-1508至-1503碱基序列中鉴定了W-box顺式元件（图S7c）。进行Y1H分析，以验证棉花Ⅰc WRKY TFs是否与GhMKK2启动子中的W-box元件结合。将棉花Ⅱc WRKY TFs插入pGADT7载体中。如图3a所示，只有阳性表达棉花组Ⅷc WRKY TFs的proGhMK2:：pAbAi Y1H菌株能够在补充有750 ng/ml AbA的SD/–Leu培养基上生长（图3a）。将表达GhWRKY33的proGhMKK2:：pAbAi Y1H菌株（acotton组ⅧWRKY TF）用作阴性对照（图3a）。使用具有突变W-box元件的proGhMKK2Mu:：pAbAi Y1H菌株来阐明棉花Ⅰ族c WRKY TFs与GhMKK2启动子中的W-box元件之间的结合是否是特异性的。用棉花组Ⅷc WRKY TFs转化后，表达proGhMK2Mu:：pAbAi的Y1H细胞在补充750 ng/ml AbA的SD/–Leu培养基上不能存活（图3a）。
为了进一步验证棉花基团Ⅷc WRKY TFs与GhMKK2启动子中的Wbox元件之间的直接相互作用，将LUC报告系统应用于烟叶。与proGhMKK2:：LUC和35S:：GhWRKYs共转化后，在烟草叶片中观察到显著的LUC活性（图3b）。此外，进行了电泳迁移率转移试验（EMSA）（ *** S2），其结果表明，棉花组Ⅷc WRKY TF（CotAD_07364、CotAD_28079、CotAD_36307和CotAD_43658）与生物素探针相互作用，当冷探针与生物素探头竞争时，结合降低。同时，突变探针的添加不影响IIc WRKY组蛋白和生物素探针之间的结合，表明IIc WRKY组蛋白与GhMKK2启动子中的W-box之间的结合特异性（图S8）。综上所述，这些数据表明棉花基团Ⅷc WRKY TFs直接结合GhMKK2启动子中的W-box元件。
Fig. 3
3.4 GhMKK2正调控棉花对Fov的抗性
分析GhMKK2表达模式以阐明GhMKK2表达是否由Fov诱导。如图4a所示，Fov感染后，GhMKK2转录水平显著升高。然后，棉花Ⅰc WRKY TF在棉花原生质体中过表达，以进一步证实其对GhMKK2表达的影响。在Ⅰc WRKY TF过表达原生质体内检测到的GhMKK2转录物水平高于对照原生质（图4b）。
采用VIGS沉默棉花中的GhMKK2并确定其功能（图S9a）。Fov感染7天后，GhMKK2沉默（CRV:：MKK）棉花比空载体对照（CRV：：00）棉花受损更严重（图4c）。还测定了病原体疾病指数。如图4e所示，CRV:：MKK2棉花的病原体疾病指数远高于CRV：：00棉花。然后，产生过表达GhMKK2的转基因烟草（图S9b），并使用6周龄的T3转基因和空载植物进行进一步分析。GhMKK2的过表达显著提高了转基因烟草对Fov的抗性，在Fov感染后5天，转基因烟草叶片的病变面积和病原体疾病指数比Vec叶片小得多（图4d和f）。此外，台盼蓝染色显示，Fov感染后，转基因烟草叶片中积累的蓝色染色比Vec叶片中的更少（图4d）。这些结果表明，GhMKK2在棉花抗Fov中起着重要作用。
Fig. 4
3.5 GhMKK2调节病原体诱导的类黄酮生物合成
对有或无Fov感染的GhMKK2沉默棉花进行转录组测序，以阐明GhMKK2调节棉花对Fov抗性的机制。Fov感染后，GhMKK2沉默棉花中23033个基因的转录发生了显著变化，10006个基因转录增加，13027个基因转录减少（表达变化>2倍，Padj<0.05）（表S7）。然后，对野生型（WT）棉花和GhMKK2沉默棉花之间的转录组数据进行补充分析，无论是否感染Fov。在WT棉花中，其表达因Fov感染而增加，但在GhMKK2沉默棉花中表达减少或未检测到的基因被认为是Fov诱导的GhMKK2调节基因。并且筛选了3026个基因（Fov感染后GhMKK2沉默棉花中623个下调基因和2403个未检测基因）（图5a和表S8）。KEGG富集分析用于确定这些筛选基因调控的关键生物学过程。
结果表明，3026 Fov诱导的GhMKK2调节基因在多个途径中富集，类黄酮生物合成途径（KEGG ID:ath00941）是最显著富集的途径（富集了33个相关基因）（图5b和表S9）。使用RT–qPCR确认了8个基因（从33个类黄酮生物合成相关基因中随机选择）的转录水平。如图5c所示，Fov感染后，GhMKK2沉默棉花中所选基因（CotAD_31067除外）的表达明显降低。
然后，在过表达GhMKK2的棉花原生质体中测量这些基因的表达水平，所有选择的基因均上调（图5d）。还测量了GhMKK2沉默棉花或GhMKK2过表达烟草中的类黄酮含量。Fov感染后，GhMKK2沉默棉花中的类黄酮含量显著降低，但在GhMKK2过表达烟草中增加（图5e和f）。
在棉花原生质体中分别过表达四个Ⅰc组WRKY TF（CotAD_07364、CotAD_52262、CotAD_45940和CotAD_ 50610），以确定II组WRKY-TF是否影响棉花中类黄酮生物合成。所选类黄酮生物合成相关基因的表达增加（图S10a）。
此外，Fov感染后，NbOE07364-1/2、NbOE43658-1/2、Nb OE45940-1/2和NbOE50610-1/2烟草品系中的类黄酮含量高于空载体品系（图S10b）。为了进一步确认IIc组WRKY TF介导的类黄酮生物合成是否需要GhMKK2级联，进一步分析了Fov感染后GhMKK2沉默棉花的RNAseq数据。尽管在Fov感染的GhMKK2沉默棉花中也诱导了大多数Fov诱导的IIc组WRKY TFs（23个中的19个）的表达（表S8），但在Fov病毒感染后，33个类黄酮生物合成相关基因的转录水平未被检测到（33个中的3个）或下调（33个中的30个）（表S7）。
基于这些结果，之一类c WRKY TFs通过促进GhMKK2介导的类黄酮生物合成来调节棉花对Fov的抗性。在棉花中沉默了Fov感染后诱导表达的两个类黄酮生物合成相关基因（CotAD_59423和CotAD_ 69868），以进一步证实类黄酮的积累有助于Fov抗性（图S11a和d）。CotAD_59423和CotAD_ 69868分别编码查尔酮异构酶（CHI）和查尔酮合成酶（CHS），这两种已知参与类黄酮生物合成的关键酶。沉默棉花中的两个基因会降低黄酮类化合物含量（图S11c和f），并造成比对照棉花更严重的损害（图S12b和e）。因此，黄酮类化合物的积累有助于棉花对Fov的抗性。
Fig. 5
3.6 GhMKK2与GhNTF6相互作用
进行Y2H测定，以鉴定棉花MAPK中MKK2介导的MAPK级联的下游成分，包括GhMPK3（CotAD_09571）、GhMPK16（CotAD_14537）、Gh MPK8（CotAD_33928）、GhMPK11（CotAD _56362）、GgMPK13（Cot AD_01707）、GhMPK16（Cot ad_11508）、GmMPK20（CotAD _66205）和GhNTF6（Cot AD _09564）。
当GhMKK2与GhNTF6共转化但不与其他GhMAPK共转化时，Y2HGold菌株在DDO、QDO和QDO/X培养基上生长，表明GhNTF 6与GhMKK2相互作用（图6a）。进行LCI分析以进一步观察它们的相互作用，结果表明，当只有GhNTF6 NLuc和GhMKK2 CLuc共转化时，检测到LUC活性（图6b）。进行共免疫沉淀（Co-IP）测定（ *** S3），结果还表明GhMKK2 MYC与GhNTF6 FLAG共免疫沉淀。总之，GhMKK2在体内和体外与GhNTF6相互作用。
Fig. 6
3.7 GhNTF6通过调节类黄酮生物合成正向调节棉花对Fov的抗性
生成GhNTF6沉默的棉花和GhNTF 6过表达的烟草用于功能测定，以最终确定GhNTF6是否通过类黄酮生物合成的调节参与Fov抗性（图S12）。如图6d所示，与GhMKK2沉默棉花相似，GhNTF6沉默棉花在Fov感染后表现出更严重的损伤。然而，与对照植物相比，在Fov感染后五天，过表达GhNTF6的烟草植物的叶片显示出更小的损伤面积（图6g）。
此外，使用台盼蓝染色法，在Fov感染后，在过表达GhNTF6的烟草叶中观察到比在空载体叶中更低的蓝色染色水平（图6g）。更重要的是，如图6e和f所示，类黄酮生物合成相关基因的表达在Fovin感染的GhNTF6沉默的棉花中下调，但在GhNTF 6过表达的棉花原生质体中上调。
此外，Fov感染后，GhNTF6沉默棉花中的类黄酮含量显著降低，但在GhNTF 6过表达烟草中增加（图6h和i）。这些结果表明，与GhMKK2类似，GhNTF6通过积极调节类黄酮生物合成，作为棉花防御Fov的积极调节因子。
Fig. 6
3.8 GhNTF6通过GhMYC2介导的途径调节类黄酮生物合成
使用GhNTF6作为诱饵，通过Y2H筛选筛选棉花cDNA文库，以进一步阐明GhMKK2-GhNTF 6级联反应Fov的机制，随后通过测序确认了61个阳性克隆。除去空克隆和重复克隆后，有效克隆对应于16个候选蛋白。在拟南芥中，据报道，AtMYC2（AT1G32640.1）是类黄酮生物合成的正调控因子，但其分子机制尚不清楚。
根据序列比对和功能预测，CotAD_32778可能是AtMYC2的同源基因。CotAD_32778的ORF由1650 bp组成，编码549个氨基酸残基。数据库搜索和生物信息学分析表明，CotAD_32778与拟南芥中的AtMYC2具有高度序列相似性，并且使用序列分析在其氨基酸序列中鉴定了一个保守的bHLH结构域（图S13）；Y2H测定的结果验证了GhNTF6和GhMYC2之间的相互作用（图7a）。还对烟叶进行LCI测定以进一步确认。在GhNTF6-NLuc和GhMYC2-Cluc共转化区观察到强烈的LUC活性（图7b）。
获得GhMYC2沉默棉花用于功能分析（图S14）。感染Fov七天后，GhMYC2沉默棉花表现出比CRV:：00棉花更严重的损害（图7c）。然后，测定了GhMYC2沉默棉花中类黄酮生物合成相关基因的表达和类黄酮的积累。过表达GhMYC2的棉花原生质体也用于测定类黄酮生物合成相关基因的表达水平。如图7d和e所示，Fov感染后，GhMYC2沉默的棉花中类黄酮生物合成相关基因的表达显著降低，但在GhMYC2过表达的棉花原生质体中增加。此外，Fov感染的GhMYC2沉默棉花中的类黄酮含量显著降低（图7f）。这些结果表明，GhMYC2可能是Fov感染反应期间MAPK级联和类黄酮生物合成之间的“桥梁”。
Fig. 7
04
结论
总之，我们的研究揭示了一种新的疾病防御机制，其中WRKY-MAPK途径促进GhMYC2介导的类黄酮生物合成，以防御病原体感染（图8）。这一途径提高了我们对WRKY TFs和MAPK级联在植物免疫中的相互作用以及植物类黄酮在病原体防御中的重要作用的理解。
Fig. 8
05
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原文链接：
https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.18329
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https://www.scientsgene.com/h-nd-118.html#_np=107_423
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END
06
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思路找不到？实验做不好？看完一篇文献就会了不同方向的文章包含不同的实验技术，但是核心思路都是相似的。大多数科研工作者是通过阅读文献获得思路，但是如果没有自己的研究基础或者研究积累，也不了解每个实验的具体原理也没有丰富的实验经历，可能花费大量时间精力还吃亏不讨好。那么，如何开展一个课题呢？下面小编就以一篇文献为例，讲述一下这篇文献中的思路和部分实验技能，希望大家能举一反三，从中学得一些“套路”。
以2015年的一篇发表在Plant Cell 题目为Systemic Immunity Requires SnRK2.8-Mediated Nuclear Import of NPR1 in Arabidopsis 的文献为例，首先小编让大家快速了解一下课题设计和主线：
图1：课题主线
不论研究对象是植物还是动物，核心思路都是这样的。查阅文献寻找背景和线索-发现表型-机制解析，基于这三点我们再根据具体课题设计各种验证实验，下面就这篇文献进行分析。
一 背景和线索
图2 ：文献背景
已有研究表明植物体被外界病原菌入侵时，入侵部位发生快速而剧烈的细胞死亡的同时会杀死病原菌,远离被病原菌感染部位的部分会通过SA激活NPR1从而诱导SAR（系统获得性抗性）。但作者发现在感染病原菌时远端的SA含量只有少量增加，说明SA调节的SAR还需要额外的因子。此外，有文献报道SnRK2.8可以磷酸化NLT6等转录因子，而NLT6参与冷诱导的抗病过程，因此推测SnRK2家族成员可能参与SAR。
二 表型发现
SnRK2家族成员是否参与SAR呢？首先作者通过体外实验发现SnRK2.8的表达量确实受外来病原菌调控；其次SnRK2.8基因超量植株相比野生型更耐细菌侵染，且对snrk2.8突变体和野生型注射病原菌，野生型中快速有效地产生SAR而突变体中不能引起SAR，说明SnRK2.8确实参与SAR过程。
图3：体外体内实验探索SnRK2.8和SAR的关系
三 机制探究
SnRK2.8蛋白在SAR中发挥什么功能呢？查阅大量文献发现SA对SAR的诱导是必须的，因此需要首先判断SnRK2.8在SAR中发挥功能是否和SA有关。到底是SnRK2.8影响SA的含量还是SA能诱导SnRK2.8的表达，或者是SnRK2.8参与SAR依赖于SA。作者利用一系列实验发现SnRK2.8不影响SA的积累并且SA不能诱导SnRK2.8的表达但是SnRK2.8调控SAR是依赖于SA的。其次，SnRK2.8作为蛋白激酶如何调控SAR？SnRK2.8是否参与已报道的调控SAR的信号 *** 呢？SnRK2.8蛋白调控的上下游是什么呢？作者通过酵母双杂、BIFC及CO-IP等发现SnRK2.8确实和已报道参与SAR过程的NPR1蛋白互作。由于SnRK2.8蛋白是激酶并且有文章报道NPR1参与SAR必须以二聚体形式进入核中才能发挥共能，最后作者确定SnRK2.8能磷酸化NPR1从而促进NPR1的入核。
图4：SnRK2.8和SA的关系分析
图5：各种体内实验验证SnRK2.8和NPR1互作
图6：体外体内实验证明SnRK2.8在SAR中调控NPR1入核过程
上述基本就是这个课题的全过程，但是文章的完成不能只有思路，还需要扎实的实验技能，思路和实验技能是相辅相成的，缺一不可。下面给大家简单介绍一下这篇文献中涉及到的部分实验技能，希望对大家有所帮助。
四 实验要点
- 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。一般我们可以通过qRT-PCR比较不同样品之间特定基因的表达量变化，此实验在这篇文献中用得相当多，算是基本操作，其中有很多需要注意的地方，下面我为大家介绍一下。
（1）RNA是否降解
Nanodrop 2000 只能检测RNA的浓度及纯度，对于RNA的完整性是没法检测的，一般实验室可以通过凝胶电泳检测，所有试剂和接触到RNA的仪器用DEPC冲洗，尽量保证胶的一致性，在nuclease-free情况下进行电泳，电压不要太高，否则因为温度高RNA会降解。
（2）cDNA 浓度是否一致
按道理说每个样品用相同含量的RNA进行反转录得到的cDNA应该一致，但是我们检测的RNA每个样品可能含有蛋白杂质，所以取的RNA模板可能不一致，先用看家基因检测一下稀释到80ng/ul左右的样品再来判断cDNA浓度是否一致。
（3）引物是否合适
做半定量PCR引物很重要，曾经看过一篇文章，作者对3kb的片段共设计了8对不同位置同样长度的引物，PCR检测表达量发现绝对量都不一样，并且引物的Tm值以及长度都影响着扩增效果。因此引物是否合适很重要，并且扩增片段长度不能太长，一般70bp到300bp都是可以的。
（4）加样一致性
做q-PCR很重要一点就是加样一致，因此我们均是配置MIX后再来分装，分装时用分装枪，因为手动加样可能会不均匀。一般使用RNA的EP管和枪头，因为RNA的枪头对于液体的粘着性比较低，可以尽量减少样品滞留在枪头上。一般每个样至少保证3个重复。
（5）PCR板保证干净
不要徒手抚摸PCR板的上方和下方，因此也不要在PCR上画标记，会影响荧光信号的采集。贴膜时一定要贴牢固了，不然可能做完RCR你的样品也蒸干了，我们实验室的新手经常犯这样的错误。
（6）冰上操作
一般做一整板PCR可能耗时太长，有的人甚至能用一两个小时，但是SYBR mix中有酶因此需要冰上操作。
2.酵母双杂交
酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录激活结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在GAL4系统中利用转录因子GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD与激活结构域GAL4-AD的特异载体，分别与基因的ORFs融合，转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。
在本文献中作者通过此 *** 证明SnRK2.8和NPR1、TGA3互作，此实验中有以下几点需要注意：
（1）验证目的蛋白自激活活性
进行筛选之前必须验证目的蛋白是否有自激活，如无自激活活性可用于酵母双杂交筛库，如有自激活必须把自激活区域去掉才能用于酵母双杂交文库筛选。有些蛋白自激活特别强，可能需要截成特别短的片段才能进行筛选，这些都需要验证。
（2）确定3-AT浓度
跟其他验证蛋白互作实验一样，酵母双杂也需要阴性对照，必须验证目的基因连接BD的菌株和包含AD空载的菌株之间不会有互作，但是一般在没有抑制剂存在时上述情况是能发生的，那么在三缺培养基上仍然能长，因此出现假阳性。所以一般用含梯度的3-AT平板先做预试验，确定在什么浓度下的3-AT能抑制目的基因和含AD的空载的互作。
（3）x-gal显色时阳性对照很重要
在酵母双杂最后，能在三缺上长出来的酵母需要进行进一步验证，就是x-gal显色。显色时必须添加阳性对照，证明显色实验没有问题，否则本来是阳性菌却被认为是假的。
（4）实验操作中的小细节
a 转化酵母时，鲑精DNA变性很重要，这是介导质粒进入酵母的辅助物；
b 在热激酵母之前，转化Mixture中每加一种组份都要吸打均匀，以免出现沉淀；在转化效率不能满足实验需要时，可增加体系中Salmon Sperm DNA的浓度。
c 确定3-AT浓度时，更好确定两次以上，因为3-AT浓度决定着你的结果是否正确。
d mating时，不要用过小的三角瓶，以免降低转化效率；摇动速度不可过高以免降低 mating 效率，也不可过低防止酵母细胞沉淀。
e 检测菌液OD600时，应稀释2倍及5倍后测定，再计算原液的浓度。
3 Pull Down 和CO-IP
简单讲Pull Down 和CO-IP都是为了验证两个蛋白是否互作的 *** ，只是一个是验证体外蛋白互作，一个是验证体内的。但是原理都是一样，都是通过标记的标签蛋白（体外一般是GST,HIS,MYB等，体内一般有HA,GFP,FLAG,Strep等标签）从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白，确认两个蛋白之间是否互作。一般是用Western blot检测。在整个过程中有哪些需要注意的呢，小编也为大家整理了一些。
（1）浓度低和纯度低的蛋白也能上样
很多人可能认为做Pull Down 和CO-IP实验的蛋白样必须高浓度和高纯度，其实不然，对于此实验我们最终是利用用Western blot来检测灵敏度相当高，此外当蛋白浓度不够时我们只需要加大蛋白量就可完成此实验；至于有杂带也没有什么影响，只要用Western blot检测时能检测到真正的目的带即可。
（2） 阴性对照很重要
很多人做Pull Down 和CO-IP会将实验组和对照组分开做，这样其实是不严谨的。我们必须保证整个实验流程一致才能证明目的蛋白之间存在互作，因为这个实验弹性很大，如果孵育时间太长，而wash时间又太短，空GST也能和目的蛋白互作，这种情况我们实验室有很多，所有不能先做实验组证明有互作了，就随便加一组对照。
（3） 孵育时间看自己
这个意思就是做Pull Down 和CO-IP的时间可以自己定，这个过程不同蛋白之间是不一样的，有的蛋白互作可能特别强，因此可以直接孵育1h就可以，有的蛋白可能互作比较弱，可能需要孵育4h或者过夜。因此这些都取决于你的蛋白之间的结合力。
（4） 预试验不可缺
什么叫预试验呢，就是对于新手来说你在做Pull Down 和CO-IP时每一步的流出液或者洗脱液都应该收集起来进行检测，这样是为了更好分析你的实验是在哪一步出错，否则实验失败以后也不明白为什么，只能无意义的重复，浪费时间和精力。例如我见过我们实验室一员她在input中检测到蛋白，在wash buffer和流出液中及elution中都没有检测到蛋白，因此她认为没有互作，其实我们应该分析蛋白去哪了，既然input有，但是哪里都没有蛋白说明目的蛋白在beads没有被elution下来，有可能互作蛋白都在beads上而你没有检测到。
（5） 蛋白提取液非常重要
不用类型的蛋白提取液不同，对于一般核或者质蛋白可能SDS溶液即可，但是对于一些膜蛋白就有特殊的提取 *** 。如果这一步不区分开可能完全没有办法进行后续实验。
4 烟草体系BIFC
在荧光蛋白（YFP、GFP、Luciferase 等）的两个β片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光，此实验都用于在烟草植株活体细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用。此实验有这几点需要注意：
（1） 农杆菌的选择
GV3101、EHA105、LBA4404 这三种农杆菌均有报道可以用于烟草瞬时转化。在培养农杆菌时候除了添加载体所含有的抗生素外，不同农杆菌还需要添加其它种类抗生素，比如 GV3101 还需要添加 50μg/ml 的利福平。
（2） 烟草状态很重要
选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射，太小的可能注射不进去，太老的表达效率较低。叶片气孔打开的时候比较容易注射，因此更好在白天注射。
（3） 适当的农杆菌菌液浓度
农杆菌菌液浓度是需要自己摸索的一个参数，OD600 = 0.6并不一定适用于所有的基因，高浓度可能导致叶片死亡，或者影响定位结果，建议设置不同浓度梯度进行比较，在可以获得荧光信号的前提下尽量采用低浓度的菌液。
（4） 农杆菌活性相当重要
在YEB中培养农杆菌时，OD一般达到0.8-1时菌的活性更佳，在0D超过1后甚至1.5后，可能因为活性不够而导致荧光很弱，最终判断错误。因此，尽量保证农杆菌活性。
（5）预试验判断转化效率
不同外源基因的瞬时表达效率大不相同——这一点在单转做亚细胞定位的时候表现得特别明显，效率高者基本每次都能达到100%发光，低者可能转10次只能表达出一两次，建议在BIFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。
（6） 观察时间
注射后的植株通常在2d之后观察，但不同基因表达的时间可能在1-7天不等，需要之一次实验时每天都观察一下，判断什么时候表达量最强。
5 蛋白质磷酸化活性分析
蛋白质磷酸化指的是由蛋白质激酶催化的把三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）或三磷酸鸟苷（Guanosine triphosphate, GTP）γ位的磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基（如丝氨酸、苏氨酸等）上的过程。本文献中以放射性同位素标记的<γ-32P>ATP作为磷酸基团的供体，SnRK2.8与待NPR1共同反应30min，之后通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分离，用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质，从而判断待测蛋白质是否具有磷酸化活性或自磷酸化活性。这里小编也总结了几点注意要点，提供大家参考。
（1）磷酸化反应过程
对于某些对特殊离子具有依赖性的蛋白激酶（如钙离子依赖性蛋白激酶），应对 kinase buffer 中的成分进行调整；此外不同类型的蛋白激酶buffer也有所不同，若是从未做过磷酸化的蛋白，需要自己尝试不同的反应体系；至于反应温度和反应时间，一般是室温反应30min，但是对于某些对温度敏感的蛋白激酶，应调整反应温度，时间也可以自己延长到6h。
（2）操作谨慎
放射性同位素操作应在规范的专用操作室内进行；含放射性同位素的废弃物（废纸、废液等）应按规定进行规范处理。
（3）蛋白活性
尽量避免待测蛋白在制备过程中活性受到损害，如果蛋白质活性不够，实验结果将完全不可信。
山东农业大学获全国大学生生命科学竞赛一等奖来源：【中华泰山网】
泰安日报社·中华泰山网讯 近日，第八届全国大学生生命科学竞赛(科学探究类)决赛在南京师范大学举办。山东农业大学共有8个团队参与角逐，其中，孙久贺团队凭借《小麦TaNiR1-4B基因的克隆及功能分析》项目获得全国一等奖，刘喆团队凭借《山东大姜根结线虫普查及其生防菌剂研发》项目获得全国三等奖。
小麦是我国重要的粮食作物之一，氮素在小麦生长发育过程中起到关键作用。为探究氮素响应基因，“小麦TaNiR1-4B基因的克隆及功能分析”实验利用缺氮、适宜和高氮3种硝态氮浓度对小麦幼苗培养，取茎尖分生组织进行转录组测序，初步筛选到一个Trihelix家族的转录因子。后续需进行高氮和缺氮条件下大田试验，验证氮素影响下TaNiR1-4B基因表达是否增大分蘖角度，计划进行酵母双杂交鉴定TaNiR1-4B互作蛋白、酵母单杂交挖掘其下游靶基因，构建TaNiR1-4B协同氮素调控小麦分蘖发生的分子调控 *** 。
根结线虫会引发大姜“赖皮病”，该病害在姜区近30%至50%地块发病，会导致生姜产量减少20%至50%，严重发病地块减产可达80%，并且危害逐年加重。目前，根结线虫病的防控策略主要包括化学防治、物理防治和生物防治。生物防治针对性强，且环境友好。基于此，“山东大姜根结线虫普查及其生防菌剂研发”项目通过采集发病地样品，进行虫口密度测定、线虫种类鉴定，进一步完善大姜线虫资源库。项目还选育出对根结线虫有理想杀虫潜力的生防菌剂，在根结线虫病生物防治中发挥作用，并且明确杀线虫活性物质及其作用机理。这不仅有助于建立生防菌剂的应用技术体系，而且对于寻找和开发高效的低毒农药具有重要意义。
据悉，“全国大学生生命科学竞赛(CULSC)”是涵盖生物、食品、医学、药学、农学、环境等高校生命科学领域的一项全国性赛事，是教育部认可的56项全国高水平学科竞赛之一，被誉为生命科学领域最权威、更具影响力的国家级大学生学科竞赛。在本届比赛中，共有来自全国562所高校的12069个团队参与，经过资格审查、 *** 评审和省级决赛，最终评选出582个参赛团队参加全国决赛答辩。
【泰安日报社·最泰安全媒体记者 杨丽宁 审核 晁彤彤】
本文来自【中华泰山网】，仅代表作者观点。全国党媒信息公共平台提供信息发布传播服务。
ID：jrtt
四川农业大学在BR调控籽粒发育研究中取得新进展责编 | 逸云
油菜素内酯（Brassinosteroid, BR）是植物特有的甾体激素，在生长发育及环境胁迫应答中起重要作用。BES1/BZR1是油菜素内酯（BR）信号途径中的唯一报道的转录因子, 在调控植物生长发育过程中发挥关键作用。关于玉米BES1/BZR1调控玉米籽粒大小未见报道。
2020年11月18日，四川农业大学玉米研究所李晚忱/付凤玲教授实验室在 Journal of Experimental Botany在线发表了题为Maize transcription factor ZmBES1/BZR1-5 positively regulates kernel size的研究论文，初步揭示了ZmBES1/BZR1-5调控籽粒大小的分子机制。
本研究通过对513个玉米自交系的基因关联分析发现，有4个ZmBES1/BZR1-5相关的SNP与粒宽显著相关，3个SNP与百粒重显著相关。在拟南芥和水稻中过表达ZmBES1/BZR1-5基因均显著增加了种子的大小和重量。另外，玉米Mu转座子插入和EMS突变体的籽粒也明显变小。ZmBES1/BZR1-5蛋白含有bHLH和BAM结构域，单体没有转录活性，但通过BAM结构域形成的同源二聚体定位于细胞核内。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶检测表明，ZmBES1/BZR1-5蛋白结合AP2/EREBP基因（Zm00001d010676和Zm00001d032077）启动子并抑制其转录。cDNA文库筛选显示ZmBES1/BZR1-5与酪蛋白激酶II亚基（ZmCKIIβ4）和铁氧还蛋白2（ZmFdx2）相互作用。综上所述，本研究表明ZmBES1/BZR1-5正向调控玉米籽粒大小，为理解玉米籽粒发育机制提供了新的思路。
Proposed model of ZmBES1/BZR1-5 positively regulating kernel size in maize
在读博士研究生孙福艾，硕士研究生丁磊为并列之一作者，李晚忱研究组付凤玲教授，于好强助理研究员为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金青年基金项目，四川省教育厅应用基础项目，转基因重大专项及学校双支计划等项目的资助。
原文链接：
https://doi.org/10.1093/jxb/eraa544
Cell虽好，学到精髓才会更上一层楼哦在丛枝菌根共生研究领域，科学家们发现植物可以根据自身的磷营养状态来调控丛枝菌根共生的效率，但是具体的作用机制却没人知道，这个问题一直困扰了科学家们50年之久！然而，就在上个月，王二涛团队经过长时间地研究探索，成功揭示了植物磷信号 *** 调控菌根共生的分子机制，其研究成果也登上了Cell杂志的封面（此处应有掌声），预计将掀起共生研究的热潮。虽然文章发表了近一个月，各大期刊竞相对其进行了解读，王二涛老师自己就文章内容也进行了多次讲座，但文章的热度仍在持续......好的文章值得我们反复阅读，因此接下来就和伯小远一起对“A phosphate starvation response-centered network regulates mycorrhizal symbiosis”再次细读一遍吧，看看王二涛老师是如何一步一步解开菌根共生的“自我调节”机制的，顺便再发现一些之前没发现的秘密！
背景介绍
磷是植物生长发育所必需的大量矿质营养元素之一，它不仅参与构成植物体内许多重要的大分子，还广泛参与植物体内众多酶促反应以及细胞信号的转导过程。磷酸盐是植物从土壤中获取磷元素的主要形式，然而磷元素主要以有机磷或难溶性磷的形式存在于土壤中，不利于植物吸收。为了提高植物对土壤中磷元素的吸收，植物体内主要包含两种途径：一种是植物根系直接从土壤中吸收营养。植物在感知到土壤中的磷浓度后，通过根的外表皮层和根毛细胞直接从土壤中吸收营养元素，这一过程被称为直接营养吸收途径（根途径），另一种是植物通过与丛枝菌根真菌共生从外界环境中获取营养，这一过程被称为间接营养吸收途径（共生途径）。
丛枝菌根共生是植物从环境中高效获取营养的重要途径，通过两个共生伙伴之间亲密的细胞接触（图1），丛枝菌根真菌从进行光合作用的寄主那里获得碳源，并向植物提供磷等矿质营养，值得注意的是丛枝菌根真菌提供给宿主植物的磷元素占宿主植物总磷获取量的70%以上。在过去50多年的研究中科学家们发现：植物可以根据自身的磷营养状态调控其与丛枝菌根真菌之间的共生，即菌根共生的“自我调节”，但其调节机制一直未知，为了探究该机制是如何运行的，作者进行了以下研究。
图1 丛枝菌根的形成过程（图片来自Microsoft Bing）。首先植物会分泌独角金内酯来诱导菌根真菌加速分支，接着菌根真菌会分泌菌根因子促进植物与其形成菌根。菌根真菌接触到植物根部以后，会附着在根表皮形成附着胞，菌丝通过附着胞穿透表皮细胞，最后进入维管组织附近的皮层细胞并在其中不断进行二叉分支，形成特有的丛枝结构。
下文出现的英文及解释
OsPHRs：磷信号 *** 的中心调控因子，本文的主角，妥妥的“明星基因”；
OsSPXs：参与维持磷稳态，在高磷酸盐条件下负调控OsPHRs；
OsEIL2：乙烯信号转导必需的基因；
OsARF12、OsARF25：磷酸盐稳态负调控因子；
OsMYBc：可以直接靶向钾转运基因OsHKT1的转录因子以调控耐盐性；
OsRAM1、OsWRI5A、OsRAD1：参与调控菌根共生的基因；
OsPT11：磷酸盐转运体；
OsAMT3;1：铵态盐转运体；
YAM：丛枝菌根共生酵母单杂交 *** ，本文的重点研究对象；
P1BS：顺式作用元件；
Pi：磷酸盐；
EMSA：凝胶迁移实验。
主要想解决的问题
探究并解析植物是如何根据自身的磷营养状态调控其与丛枝菌根真菌之间的共生（即菌根共生的“自我调节”）这一困扰科学家们多年的问题。
研究思路及实验设计
首先以水稻中的丛枝菌根共生相关基因的转录调控区域为诱饵，来筛选水稻转录因子文库，绘制丛枝菌根共生的转录调控 *** ，从而鉴定出参与调控丛枝菌根共生的转录因子，并通过进一步的分析获得核心转录因子。接着研究核心转录因子是如何调控丛枝菌根共生相关基因的表达，进而影响水稻-丛枝菌根的共生，以及磷酸盐是如何通过以核心转录因子为中心的调控 *** 来调控丛枝菌根共生，从而解析菌根共生的“自我调节”问题。
做了哪些实验
01 研究丛枝菌根共生的调控 ***
（1）绘制水稻-丛枝菌根共生转录调控 ***
——酵母单杂筛库、RNA-seq
实验流程：以参与或调节丛枝菌根共生的51个水稻基因的启动子为诱饵（图2A），利用包含1570个水稻全长转录因子的文库进行酵母单杂交筛库。
实验结果：文库筛选获得了一个由266个转录因子和47个启动子高度关联的 *** ，作者将其称为“丛枝菌根共生酵母单杂交 *** （YAM）”（图3A）。在该 *** 中，每个启动子平均可以和4个转录因子互作。 *** 中的266个转录因子分属于至少11个转录因子家族。72%（192/266）的YAM转录因子在根中存在表达（
（2）研究YAM节点在丛枝菌根共生中的作用
——转基因水稻根部丛枝菌根定殖分析
实验流程：通过在水稻RNAi和突变体植株根部接种丛枝菌根真菌，验证这些YAM *** 节点基因在菌根共生中的功能。
实验结果：与野生型相比，OsEIL2 RNAi植株中丛枝菌根真菌的定殖率更高（图3C）。由于OsEIL2可以调控丛枝菌根共生特异性H+-ATPase OsHA1的表达，因此推测乙烯信号可能会抑制丛枝菌根共生。水稻根系发育所必需的OsARF12和OsARF25是磷酸盐稳态负调控因子，与野生型相比，Osarf12/25双突变体根部丛枝菌根定殖率显著降低（图3D）。敲除参与菌根共生的OsRAM1、OsWRI5a/b基因后植株根部丛枝菌根定殖同样显著减少（图3E-F）。MYB型转录因子OsMYBc可以直接靶向钾转运基因OsHKT1调控耐盐性，与野生型相比，O *** ybc突变体根部丛枝菌根定殖水平也下降（图3G），这表明耐盐性和丛枝菌根共生可能受到共同调控。
结论：以上结果表明丛枝菌根共生酵母单杂交 *** （YAM）中的节点参与调节植物根部丛枝菌根共生。
图2 Y1H实验所选的基因示意图以及YAM中节点基因的表达模式。
图3 丛枝菌根共生的调控 *** 。
02 研究PHR为中心的调控 *** 如何调控丛枝菌根共生
（1）分析获得核心转录因子
——酵母单杂数据分析、启动子序列预测分析
实验流程：结合酵母单杂筛库的实验结果，进一步对菌根共生响应基因的启动子序列进行预测分析，以获得丛枝菌根共生调控 *** 的核心转录因子。
实验结果：酵母单杂筛库分析结果显示，磷酸盐饥饿响应因子OsPHR1/2/3可以激活51个靶启动子中的25个，包括关键转录因子（OsRAM1、OsRAD1和OsWRI5A）、磷酸盐转运体（OsPT11）以及铵态盐转运体（OsAMT3;1），其中OsRAD1、OsRAM1和OsWRI5自身也可以调节许多菌根共生相关基因的表达（图4A）。进一步分析发现87%的菌根共生响应基因会受到OsPHR1/2/3的调控，其中42%受到OsPHR1/2/3的直接调控（图4B）。
结论：OsPHR1/2/3可能是丛枝菌根共生调控 *** 中的一个关键调控枢纽。
（2）研究OsPHR如何调控OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11和OsAMT3的表达
——EMSA、荧光素酶报告实验、构建敲除载体、水稻遗传转化、GUS报告基因检测、丛枝菌根染色
实验流程：首先通过EMSA实验探究OsPHR1/2/3是否通过P1BS元件与OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11和OsAMT3基因的启动子直接互作；接着结合荧光素酶报告基因实验确定OsPHR2能否在植物中激活这些启动子；最后通过敲除OsPT11启动子区域的P1BS元件来判定P1BS调控元件是否对菌根特异性标记基因的表达至关重要。
实验结果：EMSA实验表明OsPHR1/2/3可以与OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11以及OsAMT3启动子区域的P1BS元件直接相互作用（图4C-D）。荧光素酶报告基因实验进一步证实OsPHR2能够激活植物中的菌根特异性基因的启动子（图4E-F）。GUS报告基因检测则证实了P1BS元件有助于丛枝菌根诱导的OsPT11在含丛枝的细胞中表达（图4G）。
结论：OsPHRs可以通过与菌根特异性基因启动子区域的P1BS元件结合，从而直接激活启动子。
图4 OsPHR2通过P1BS元件直接调控丛枝菌根相关基因表达。
（3）研究OsPHRs对水稻根部丛枝菌根定殖的影响
——OsPHRs突变体和过表达根部丛枝菌根定殖分析、丛枝菌根染色、不同Pi浓度水培实验、RT-qPCR
实验流程：通过敲除和过表达OsPHRs观察水稻根部丛枝菌根的定殖情况。
实验结果：与野生型相比，接种丛枝菌根真菌2、4、6周时，Osphr2-1和Osphr1/2-1/3突变体根中丛枝菌根真菌定殖均减少（图5A-D）。而在Osphr2-1中回补OsPHR2后，突变体根部的丛枝菌根真菌定殖率与野生型相近（图6A-C）。通过对野生型和Osphr2-1突变体的定植根和非定植根进行转录组测序，结果显示OsPHR2的功能缺失改变了63%丛枝菌根共生相关基因的表达（图6E-F）。与野生型相比，OsPHR1和OsPHR2的过表达可以显著增加水稻根部丛枝菌根真菌的定殖（图5E、G；图6G-J）。且OsPHR2-OE植物对磷酸盐介导的丛枝菌根共生抑制不敏感（图5F、H）。
结论：OsPHRs是参与调控丛枝菌根共生的关键转录因子，OsPHRs的过量表达能够显著提高水稻根部丛枝菌根真菌的定殖。
图5 丛枝菌根共生需要OsPHR2。
图6 丛枝菌根共生中OsPHR1/2/3的功能冗余。
03 研究磷酸盐如何通过以PHR为中心的 *** 调控丛枝菌根共生
——荧光素酶报告实验、不同Pi浓度水培实验、Osspx突变体根部丛枝菌根定殖分析、Pi浓度测定、RT-qPCR、丛枝菌根染色
实验流程：在植物中，SPX蛋白在高磷条件下与OsPHR2结合，从而抑制OsPHR2与磷酸盐饥饿诱导（PSI）基因启动子中P1BS元件的结合，并降低PSI基因的表达。因此，首先利用荧光素酶报告实验探究OsSPX1是否可以特异性抑制OsPHR2介导的菌根共生相关基因启动子的激活；接着通过过表达和敲除OsSPX基因来探究对水稻生长以及丛枝菌根共生的影响。综上共同解析磷酸盐是通过何种途径来调控丛枝菌根共生的。
实验结果：荧光素酶报告实验证实，OsSPX1可以特异性抑制由OsPHR2介导的菌根共生相关基因OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11以及OsAMT3启动子的激活（图7A-B）。OsSPX1、OsSPX2的过量表达可以显著抑制水稻根部的丛枝菌根定殖（图7C）。Osspx1/2/3/5四突变体在Pi缺乏（10mM Pi）和Pi充足（200mM Pi）条件下均表现出显著增强的磷酸盐饥饿反应（图7D-F），并且Osspx1/2/3/5四突变体中丛枝菌根定殖率显著上升（图8A-C）。且对磷酸盐介导的丛枝菌根共生抑制不敏感（图8D-G）。
结论：SPX蛋白通过以PHR为中心的调控 *** 负向调控丛枝菌根共生。
图7 SPX蛋白通过OsPHR2负调控丛枝菌根共生。
图8 Osspx1/2/3/5四突变体对Pi处理不敏感。
主要结果
OsPHRs通过与P1BS元件结合直接调控菌根共生相关基因OsRAM1、OsPT11、OsWRI5A、OsAMT3;1的表达。SPX蛋白（磷酸盐传感器）在高磷条件下与OsPHR2结合，抑制其与菌根共生相关基因启动子中的P1BS元件结合，从而降低了这些基因的表达，进而抑制丛枝菌根共生。OsPHR过量表达植株和Osspx缺失突变体的丛枝菌根共生对高磷处理不敏感，这表明高磷可以通过PHR-SPX模块抑制丛枝菌根共生。
图9 以OsPHRs为中心的 *** 控制丛枝菌根共生。
伯小远叨叨
文章解读至此，相信大家对水稻-丛枝菌根共生的转录调控 *** 都有了一定的了解，王二涛老师课题组的该项研究，不仅回答了困扰科学家们50多年的菌根共生的“自我调节”问题，还为降低农业磷肥的施用提供了新的策略。细读文章发现王二涛老师用到的实验 *** 其实也都是一些常用的 *** ，所以支撑这篇文章上Cell的并不是什么高端的实验技术，而是王二涛老师的思路，也许我们现在还没有这样的好思路，但是多学习这种好文章，终有一天我们也可以有好的idea！
再回到这篇文章本身，酵母单杂筛库实验在我们看来往往都是平平无奇的，但是就是这样不起眼的实验却为本篇文章打下了坚实的基础，后续的实验基本都建立在酵母单杂筛库实验的基础上，通过一些基因功能研究常用的实验手段解析了相关的分子机制，所以如何用普通的实验做出重要的结果就要看自己的本事啦！希望大家终有一天也可以练就一身这样的本事！
最后，伯小远也希望有更多的研究能够助力农业生产的可持续发展，把论文写在祖国的大地上！
聚半乳糖醛酸酶基因家族分析中，FcPG12是无花果果实软化的参与者文 | 小魏档案
编辑 | 小魏档案
?——【·前言·】——?
质地变化是果实成熟的一种特征性、不可逆的现象，伴随着一系列其他生理生化变化，如糖分积累、变色、香气发育等。
这些变化是由一系列果实成熟相关基因的时空表达引起的。成熟果实的质地变化主要是由于果胶降解，细胞壁松弛和膨胀以及纤维素和半纤维素的分解。
细胞壁多糖的分解涉及多种酶和蛋白质的协同作用，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶酸裂解酶、内转糖基酶/水解酶、膨胀蛋白等。
一、PG家族在植物中的功能
PG是更大的水解酶家族之一，属于糖苷水解酶家族28。PG基因家族已在许多水果物种中鉴定。
包括甜樱桃中的45PGs，猕猴桃中的51PGs，葡萄中的35PGs，梨中的61PGs和桃子中的45 PGs，在拟南芥中已鉴定出66例PG。
PG家族广泛参与各种组织生长和扩张所需的细胞壁修饰，如芽，叶和根，以及器官脱落。不同PGs的转录水平直接或间接受植物激素、温度和紫外线等内部和外部因素的调节。
PG家族成员对果实发育和成熟感兴趣。在石蒜茄属一个由54个成员组成的家族中，有14个PGs被鉴定为与果实发育有关。
在猕猴桃中，15个PG与果实成熟密切相关，AaPG1被发现参与猕猴桃成熟过程。在木瓜中，CpPG1被发现在果实软化中起关键作用。
草莓果实软化过程中FaPG17的表达增加，反义FaPG38延缓软化。在甜樱桃中，PavPG的瞬时过表达降低了果实硬度以及离子连接果胶和共价果胶含量，增加了水溶性果胶的含量。
二、PGs的表达在果实成熟和软化中的影响
与果实成熟和软化相关的PGs的表达受许多转录因子的调节，包括APETALA2/乙烯反应因子家族转录因子、NAC家族和MADS-box家族。
具有核心序列AGCGCCCC的GCC-box通常是一种顺式作用元件，由靶基因启动子上的AP2/ERF蛋白直接结合。
敲除番茄中的SlERF52导致脱落层中TAPG1、TAPG2和TAPG4下调。在桃子中，PpERF2直接与PpPG1启动子结合，并在果实软化过程中抑制PpPG1的表达。
三、影响果胶增溶的因素
无花果是最早驯化的果树之一，它对种植环境适应性强，并产生可观的经济价值。无花果果实具有更年期性质。
成熟后果实硬度迅速下降，使其极不耐贮运，阻碍了其作为新鲜水果的使用。当果实生理成熟并开始软化时，无花果容器和果肉中果胶和半纤维素的含量和状态会发生变化。
果胶增溶与PG和果胶甲基酯酶酶的活性较高有关。FcPG1和FcPG2的表达模式已被分离和鉴定，但该研究对基因结构和序列的信息不完整，基因的功能也未得到验证。
虽然质构的变化是影响新鲜无花果货架期的重要生物学特征，但对无花果中PG的研究缺乏深入研究，果实成熟和软化的关键PG尚未确定。
四、FcPG12在无花果成熟过程中的影响
在果实表达的FcPGs中，转录本c43883g4表现出独特的表达特征。幼果中几乎没有c43883g4的表达，但从成熟开始就迅速而持续地增加，当时其水平远高于其他FcPG。
一般来说，串联重复区只有一个基因表现出相对较高的表达，而其他基因要么表达低，要么根本没有转录产物。
在我们的研究中，FcPG12与转录本c43883g4最相似，当分别使用五个特异性引物检测五个PG基因的转录本时，仅鉴定出FcPG12转录本。
通过多克隆测序验证了没有扩增转录本的SNP碱基的纯FcPG12，并且在qRT-PCR中仅存在单峰熔解曲线，FcPG12是该基因簇果实发育过程中转录的主要成员。
爆炸比对分析表明，本研究中的FcPG12和FcPG39分别对应于先前在GenBank上报道和发表的FcPG1和FcPG2序列。
在系统发育树中，FcPG12聚集在进化枝C上，与该进化枝上其他物种的关键PG具有很强的同源性。
然而，它与进化枝B有遥远的关系，后者也携带许多关键的果实软化相关的PG。似乎不同物种果实软化的关键PGs在不同的系统发育分支上。
PG结构域高度保守，但不同物种间PG蛋白序列差异较大。为了获得FcPG12影响果实软化的证据，我们在图中对FcPG12进行了瞬时过表达。
PG酶活性的增加以及容器硬度的降低表明，FcPG12通过降解果胶在果实软化中起重要作用，这与猕猴桃中AaPG18过表达的结果相似。
鉴定关键PG基因是改善果实贮藏和延长保质期的基础。利用CRISPR/Cas9技术在番茄的SlPG基因中获得4bp和10bp缺失以及1bp插入。
SlPG的移码突变导致氨基酸翻译提前终止，从而延缓果实软化。另一项研究采用病毒诱导的基因沉默技术干扰桃β-半乳糖苷酶基因的表达。
导致PpPG21和PpPME3表达降低及其相应的酶活性，抑制桃果软化。MdPG1在“RoyalGala”苹果中的干扰导致果胶降解率降低，果实硬度增加。
作为无花果中关键的糖苷水解酶，调节FcPG12的表达可能是减缓果实快速软化和改善其质地的重要途径。
五、转录因子对FcPG12的表达调控
了解FcPG12表达调控对分析无花果成熟过程中软化机理具有重要意义。FcERF5在果实软化过程中的表达模式与FcPG12相似，随着无花果开始成熟而增加。
通过Y1H和双荧光素酶报告基因测定，我们验证了FcERF5通过与FcPG12启动子结合作为FcPG12的激活剂。
这与最近的一篇报道一致，即PpERF/ABR1通过与PpPG启动子结合来促进桃中PpPG的表达。FcERF5的亚细胞定位支持细胞核中调节过程的发生。
8FcERF5过表达后的果实硬度和PG酶活性与FcPG12过表达后相似，进一步证明了FcERF5上调FcPG12并促进果实软化。
AP2/ERF是一个大家族，包括许多与图果成熟和软化相关的成员，FcERF62也具有与FcPG12相似的表达特征，FcERF62属于FcERFIV亚科。
FcERF62的表达随着果实发育而逐渐增加。果实成熟时，果肉丰度更高，而在果皮中表达量较低。FcERF62在乙烯利处理的果实中表达增加。
除这些FcERFs外，加权基因共表达 *** 分析显示，共表达模块“MEcyan”和“MEblack”中的FcMYB108、FcMYB4、FcbHLH137、FcbHLH149和FcNAC29具有与FcPG12相似的表达特征。
据报道，RhMYB108与FcMYB108高度同源，参与乙烯和茉莉酸诱导的玫瑰花瓣衰老。NAC基因家族成员在乙烯和ABA信号转导途径中起重要作用。
它们参与细胞壁修饰基因的精细调控，并在果实成熟和软化过程中调节质构变化中发挥作用。AtNAP与FcNAC29密切相关，可能在活性细胞分裂和细胞扩增之间的过渡中起作用。
在FcPG12启动子上预测MYB和NAC转录因子结合位点。然而，需要更多的实验证据来揭示FcPG12表达调控的全景。
六、镰刀镰刀中PG基因家族的鉴定
以拟南芥PG蛋白序列为查询对象，汇集招募的67个序列，共获得65个PG候选序列;通过检索图基因组数据库的GH56HHM图谱筛选28个序列，并删除重复序列。
通过CDD数据库检索和基序测试去除缺乏PG结构域特征的蛋白质序列后，鉴定出43个PG。PG基因根据其在染色体上的位置被命名为FcPG1至FcPG43。
1FcPGs长252-974个氨基酸，计算出的相对分子质量为2.75-10.38kDa，预测pI为4.86-9.82。大约一半的FcPG蛋白含有SignalP预测的信号肽序列。
为明确FcPGs的进化关系和功能差异，采用ML *** 构建了无花果、拟南芥和19个PG基因的系统发育树。FcPG可分为14个进化枝，其中D进化枝有1个基因，更大。
FcPG1、9、10、11、12和13的Ka/Ks比值为0.17–0.54。值<1表明这些基因处于纯化选择之下，并且编码蛋白质的功能得以保留。
FcPG1的Ks高于其他基因，表明FcPG1是之一个被分离和分化的基因。我们估计FcPG9，10，11，12和13的串联重复发生在2.8-19.3百万年前，而FcPG1的串联重复至少发生在10万年前。
七、FcPGs的基因结构、保守基序和结构域分析
PG蛋白的氨基酸序列通常包含四个保守结构域-SPNTDG，GDDC，CGPGHG和RIK，以及三个半胱氨酸位点。
多序列比对表明，大多数FcPG具有四个保守结构域，这些结构域对PG的水解活性至关重要。FcPG38、40、14、27、24、29和5缺少一个或两个典型的PG结构域。
在同一分支的FcPG成员中发现了相似的基因结构和组成。FcPG有3-15个外显子和2-14个内含子。
在进化枝A和G的成员中发现较少的外显子/内含子，而在大多数其他FcPG中发现4个外显子/内含子。
大多数FcPG没有非编码区域结构，具有非编码区结构的FcPGs主要集中在进化枝E和F上，当43个FcPG蛋白序列对齐时，获得了3个保守基序。
在系统发育树的每个分支中，保守基序的组成和位置顺序通常是相似的。基序2和43存在于所有5个PG蛋白序列中。基序5在FcPG29和FcPG3中不存在，基序3在分支F的成员中不存在。
根据NCBI的CDD数据库，大多数PG蛋白结构域属于PL-6，进化枝D上的成员属于PLN1超家族，进化枝F上的成员属于Pgu3家族。
八、总结
无花果树具有很高的经济价值。然而，由于快速软化，它的果实保质期很短。聚半乳糖尿酸酶是必需的水解酶，负责果胶降解，在果实软化中起关键作用。
无花果PG基因及其调节因子尚未表征，在这项研究中，在无花果基因组中鉴定出43个FcPG。
它们不均匀地分布在13条染色体上，并且在4号和5号染色体上发现了串联重复PG基因簇。Ka/Ks计算和共线分析表明，负选择是FcPG家族扩展的主要驱动力。
无花果中FcPG表达10个，FPKM值>12，其中4个与果实软化呈正相关，12个与果实软化呈负相关。12个FcPG上调，5个下调响应乙烯利处理。
FcPG12是5号染色体串联重复簇的成员，由于其在果实软化过程中转录本丰度急剧增加及其对乙烯利处理的反应而被选中进行进一步分析。
FcPG12的瞬时过表达导致无花果果实硬度降低，组织中PG酶活性增加。在FcPG启动子上发现了两个乙烯响应因子结合的GCC盒位点。
酵母单杂交和双荧光素酶测定表明，FcERF直接与FcPG启动子结合并上调其表达。FcERF的瞬时过表达上调了FcPG的表达，从而增加了PG活性和果实软化。
在这项研究中，首次在无花果基因组中鉴定出43个FcPG。根据其基因结构、基序和顺式作用元件特性，分为12组。
基于RNA-Seq数据分析、基因克隆和序列比较，分离出FcPG12是与果实软化有关的关键PG。瞬时过表达和qRT-PCR分析证实了FcPG5促进果实软化的功能。
本研究结果为探索无花果软化的分子机制提供了依据，也为了解ERF在果实软化过程中如何调控细胞壁修饰PG基因转录提供了依据。
